柯弗氏細胞（Kupffer cells, KC)-肝臟之巨噬細胞

柯弗氏細胞（Kupffer cells, KC）在肝臟生理學和各種肝臟疾病的發病機理中具關鍵作用。KC佔體內存在的組織巨噬細胞 (tissue macrophages ) 的80-90％。 它們存在於肝竇 (liver sinusoids) 內腔中，因此經常暴露於腸源細菌 (gut-derived bacteria) ，微生物碎片 (microbial debris ) 和細菌內毒素 (bacterial endotoxins)，已知其可激活巨噬細胞 ( macrophages)。 激活後，KC釋放各種產物，包括細胞因子( cytokines)，前列腺素(prostanoides)，一氧化氮(nitric oxide )和活性氧(reactive oxygen species)。 這些因子調節KC本身的表型，以及鄰近細胞的表型(phenotypes)，例如肝細胞(hepatocytes)，星狀細胞( stellate cells)，內皮細胞(endothelial cells )和其他通過肝臟的免疫細胞( immune cells)。 因此，KC與肝臟對感染( infection)，毒素(toxins)，缺血( ischemia)，切除和其他壓力的反應密切相關。 資料來源: Liver Int. 2006 Dec;26(10):1175-86。

細胞系列商品 (immortalized cell)-不朽化庫普弗細胞（Kupffer cells, KC）

Immortalized Mouse Kupffer Cells (ImKC)柯弗氏細胞株  | 貨號T0062 細胞數量 ≥1×10⁶ cells / 1.0 ml

產品介紹: 分離的原代KC ( Isolated primary KC) 在培養中具有有限的壽命，並且由於獲得的數量相對較少，因此限制了它們的體外研究。轉基因小鼠建立產生細胞因子的永生化KC（ImKC）系 (cytokine-producing immortalized KC) 。永生化柯弗氏細胞株（ImKC）從雄性H-2Kb-tsA58轉基因小鼠 (H-2Kb-tsA58 transgenic mice) 中分離，該小鼠表達SV40大T抗原的不耐熱突變體tsA58 (thermolabile mutant tsA58) ，並通過鑑定F4 / 80標記 (F4/80 marker) F4 / 80 +細胞的分選。在KC的小中間群體中鑑定出ImKC，其維持F4 / 80的穩定表達，以及表面抗原CD11b，CD14和TLR4。 永生化細胞表達p53水平，增加端粒酶活性 (telomerase activity) ，並保留與原代細胞 (primary cells) 相比的一些功能特徵。 ImKC細胞可以在37℃下不存在IFNγ的情況下繁殖，並且當用脂多醣（LPS）誘導時能夠產生促炎細胞因子 (proinflammatory cytokines) 。 這些細胞對於促炎細胞因子（TNF-α，IL-6和IL-1β）及其在Kuppfer細胞，肝損傷 (liver injury) 過程和慢性病 (chronic diseases) 研究中的作用具有重要價值。這些結果表明ImKC系保留了原發性KC的關鍵特徵，因此提供了評估KC在肝損傷和慢性疾病中的作用的有用工具。 引用文獻 DOI: 10.1016/j.cyto.2014.07.251.

ImKC柯弗氏細胞株 |來源雄性H-2Kb-tsA58轉基因小鼠 (H-2Kb-tsA58 transgenic mice) 中分離 | 細胞培養條件: 使用PriCoat™T25培養瓶 (貨號G299)，表面塗有I型膠原組成的細胞外基質，以最佳化初代和不朽細胞的生長、增殖和擴增。或塗層細胞外基質(Applied Cell Extracellular Matrix) 增強細胞貼附 (貨號G422)。Grow cells in ECM-coated culture vessels with the following conditions. 培養液PriGrowII (貨號 TM002)。為了製備完整的生長培養基，將下列組分添加到基礎培養基中：胎牛血清（TM999）至最終濃度10％ (heat-inactivated)和Penicillin/Streptomycin青黴素/鏈黴素溶液（G255）至最終濃度為1％。二氧化碳（CO2）：5％，溫度：37.0℃。

細胞特性鑑定: 流式細胞術用於分析細胞表面標誌物F4 / 80，CD11b，CD14和TLR4。Western blot分析p53表達。qRT-PCR用於分析LPS誘導的細胞因子產生水平。

Organism	H-2Kb-tsA58 transgenic mice
Source Organ	Liver
Donor Gender	Male
BioSafety Level	II
Growth Properties	Adherent
Morphology	Macrophage-like
Recommended Seeding Density	4000-8000 cells/cm2
Population Doubling	~ 24 hrs
Immortalization Method	Isolated from transgenic mice expressing thermolabile mutant tsA58 of SV40 40 large T antigen
Description	Immortalized Mouse Kupffer Cells (ImKC) are isolated from male H-2Kb-tsA58 transgenic mice which expresses the thermolabile mutant tsA58 of SV40 40 large T antigen and were sorted through identifying the F4/80 marker. The immortalized cells expresses p53 levels with increases telomerase activity and retains the some functional features compared to the primary cells. ImKC cells can propagate without the presence of IFNy at 37°C, and are able to produce proinflammatory cytokines when induced with lipopolysaccharide (LPS). These cells are valuable for studies in proinflammatory cytokines (TNF-α, IL-6 and IL-1β) and their roles in Kuppfer cells, in processes in liver injury, and for research in chronic diseases.
Depositor Information	Indiana University
Applications	For Research Use Only
Markers	F4/80, CD11b, CD14, and TLR4

Abmgood不朽化系列商品 (immortalized reagenet) Ready-to-use黴漿菌PCR偵測 | DAPI染核 | 細胞內黴漿菌去除劑 | 水浴槽抑菌劑 | 噴霧式去黴劑 等系列商品

Abmgood公司於人類與老鼠不朽之細胞株上，具有幾十年的實驗經驗；提供一系列不朽 (immortalized)化之細胞株、及不朽化之試劑商品。ready-to-use定量好之retrovirus、lentiviru、 adenovirus，可直接加於細胞中進行感染表現；病毒液包括有SV40重組病毒、EBV重組病毒、hTERT病毒液、Myc基因病毒液、p53基因病毒液、Rb基因病毒液、Ras基因病毒液。提供106及109兩種包裝力價之病毒液；亦提供一系列病毒力價濃縮與定量試劑商品。

細胞不朽化的工具中，SV40 T antigen是最簡單且最常用來造成不朽化細胞生成的方法。多數的病毒基因和抑癌基因（p53、Rb等）的不活化相關，會誘導細胞處於replicative senescence的階段。目前也有研究顯示被感染的細胞，SV40 T anbtigen會誘導端粒酶（Telomerase）的活性。與端粒（telomere）長度相關的Telomerase Reverse Transcriptase protein (TERT)是一種不朽細胞的研究應用。平常細胞中，hTERT是處於不活化態，必要時會進行活化保持telomere的長度，避免細胞發生replicative senescence的現象。某些細胞hTERT 過度表現（over-expression）對於誘發細胞不朽化是無效的（如初代上皮細胞），反而會造成細胞死亡；同時表現hTERT catalytic subunit以及p53或RB siRNA在人類初代卵巢上皮細胞會造成細胞不朽化。過度表現Ras或Myc T58A mutants也有初代細胞不朽化的現象產生。

Decomplement加熱非活化FBS：

1.讓FBS瓶在4°C下完全解凍過夜。

2.將FBS瓶置於56°C的水浴中30分鐘。

Decomplemented FBS可以在-20°C下長期保存。避免頻繁的凍融循環。每2-3天更換一次完整的媒體。不要讓介質顏色變為黃色。

Thawing細胞解凍方法：(每種細胞建議條件可能有許不同，依照原廠建議操作，以下為通用方式)

1.在37℃水浴中解凍小瓶，直到只有一小塊冰塊。

2.將細胞轉移到含有5ml pre-warmed complete media 之15ml管中。

3.將細胞以290xg離心5分鐘。

4.小心丟棄上清液，不要打擾細胞沉澱，輕輕地上下移液，將細胞重新懸浮在1ml完全培養基中。

5.將細胞培養在150,000-200,000個細胞/ cm2。

Subculture細胞繼代方法: (每種細胞建議條件可能有許不同，依照原廠建議操作，以下為通用方式)

1.當細胞70-90％ confluency時，建議繼代培養。

2. Aspirate old media。懸浮液中的一些細胞仍然是活細胞。或者，也可以收集含有懸浮細胞的上清液並離心（Skip to Step 6 in protocol）。

3.加入1：1比例的1X無菌PBS和0.25％胰蛋白酶-EDTA（TM051）。

4.在室溫下孵育細胞3-5分鐘並攪拌培養容器直至90％的細胞脫落。

5. 中和胰蛋白酶:添加等量之trypsin + PBS。

6.收集細胞並以290xg離心5分鐘。

7.丟棄上清液，輕輕地上下移液，將細胞重新懸浮在完全培養基中。

8.建議split ratio比不超過1：3。

Freezing細胞凍結：(每種細胞建議條件可能有許不同，依照原廠建議操作，以下為通用方式)

Complete growth medium with decomplemented FBS to a final concentration of 50% from PAN Biotech (P40-37500) or from Nucleus Biologics (FBS1824-001) and 5% DMSO.

儲存溫度：液氮氣相。重要提示：此細胞係對FBS批次非常敏感。建議最終用戶使用從PAN biotech或Nucleus Biologics 之FBS。