抗體標記法注意事項-緩衝液和添加劑、抗體濃度和純度

抗體由胺基酸組成；賴氨酸側鏈（帶有 -NH2 末端，伯胺）通常用於將標記物共價連接到抗體分子。只有四種常見的標記方法，其不同之處在於反應性標記的創建。

抗體標記的四種主要化學方法總結如下：

1. NHS 酯： 

   對於螢光染料標籤，通常會購買帶有內建 NHS 酯（也稱為「琥珀醯亞胺酯」）的活化形式的標籤。活化的染料可以在適當的條件下與抗體（所有抗體都具有多個賴氨酸基團）反應。在將標記的抗體用於免疫測定之前，透過幾種可能的方法（通常是柱層析法）之一去除過量的活性染料。

2. 異雙功能試劑： 

   如果標記是蛋白質分子（例如HRP、鹼性磷酸酶或藻紅蛋白），則抗體標記過程會因為抗體和標記具有多個胺而變得複雜。在這種情況下，通常修飾一個分子（例如抗體）上的一些賴氨酸以創建新的反應基團（X），並修飾標籤上的賴氨酸以創建另一個反應基團（Y）。 「異雙功能試劑」用於引入 Y 基團，隨後當抗體和標記混合時，Y 基團與 X 基團發生反應，從而產生異二聚體綴合物。這個主題有很多變化，您會在文獻中找到數百個關於使用異雙功能試劑來創建標記抗體和其他標記生物分子的例子。

3. 碳二亞胺： 

   這些試劑（EDC 是一個非常常見的例子）用於在含胺分子和含羧基分子之間建立共價連接。碳二亞胺會活化羧基，然後活化的中間體被胺（例如由抗體上的賴氨酸殘基提供）攻擊。碳二亞胺通常用於將抗體與羧化顆粒（例如乳膠顆粒、磁珠）以及其他羧化表面（例如微孔板或晶片表面）綴合。碳二亞胺很少用於將染料或蛋白質標記附著到抗體上，儘管它們在 NHS 活化染料的生產中很重要（見上文）。

4. 高碘酸鈉： 

   這種化學物質不能與絕大多數標記一起使用，但它是一種非常重要的試劑，因為它適用於最受歡迎的診斷酶 HRP。高碘酸鹽會活化 HRP 分子上的碳水化合物鏈以產生醛基，該醛基能夠與抗體分子上的離胺酸反應。由於 HRP 本身含有很少的離胺酸，因此相對容易產生抗體-HRP 綴合物，而無需顯著的 HRP 聚合。

您可以從任何有關抗體標記的專業書籍中找到有關這四種方法的更詳細說明。

緩衝液和添加劑 – 抗體標記的關鍵注意事項(Buffers and Additives – Key Considerations for Antibody labeling)

重要的是要記住，您的抗體將含有抗體以外的物質；至少緩衝液和/或鹽，以及可能的其他蛋白質和添加劑。當抗體最初被純化和配製時，混合物與標記方法的兼容性可能不是關鍵考慮因素；有時在進行標記反應之前需要重新純化抗體。純化(Purification)可能涉及去除穩定蛋白(stabilizing proteins)（例如 BSA）或去除低分子量物質(low molecular weight substances)，例如疊氮化鈉(sodium azide)、tris 緩衝液(tris buffer )或甘氨酸(glycine)。不同的標記方法可能會受到不同程度的不同添加劑的負面影響，但如前所述，大多數標記方法利用抗體上的賴氨酸殘基(lysine residues )，因此在抗體標記過程中通常應避免使用具有伯胺(primary amines )的物質。例如，甘氨酸(glycine)通常用於從抗原親和柱上洗脫抗體(elute antibodies)，並且以這種方式純化的抗體應在用於標記反應之前進行透析(dialysed)。人們應該特別注意透析(dialysis )，如果更換緩衝液兩到三次，去除不需要的低分子量物質會更有效。這並不意味著您必須製作三倍的緩衝液，恰恰相反，儘管透析過程所需的總時間會更長。例如，計算表明，針對 3 x 1L 體積的透析比針對單一 5L 體積的透析更有效。通常建議使用 PBS、MES 或碳酸氫鹽作為進行綴合反應的合適緩衝液；最佳緩衝液根據標記反應的 pH 要求來決定。

抗體濃度和純度 (Antibody Concentration and Purity) 

對於大多數標記反應，抗體需要相當純淨（例如>90%，優選>95%）並且濃度>0.5mg/ml。許多市售抗體都以適合標記的形式提供，但您應該意識到情況並非總是如此。例如，抗體可以以雜交瘤組織培養上清液(TCS)、腹水或粗血清的形式出售。 TCS 通常含有許多其他蛋白質和培養物營養物質（例如胺基酸），這是特別有問題的。如果 TCS 是您的起點，則或多或少必須進行純化（例如在蛋白 A 柱上）。腹水和粗血清的抗體濃度比TCS高，但這些材料不純且含有高濃度的胺基酸；通常需要進一步純化抗體。

此時，提供上述內容的總結可能很有用：您現在了解 (i) 直接檢測和間接檢測之間的主要差異； (ii) 抗體標記的四種主要方法； (iii) 緩衝液配方的重要性； (iv) 抗體濃度。

事實上，如今，由於抗體標記技術的進步，任何會使用手持式移液管的人都可以輕鬆製作標記抗體。以下討論 Lightning-Link 一步式抗體標記方法

Lightning-Link – 世界上最簡單的抗體標記試劑盒

抗體標記過程的簡化（最顯著的是消除柱分離步驟）避免了多年來困擾傳統程序的許多問題——材料損失、柱層析過程中的樣品稀釋、批次間差異以及擴大規模的困難。

Lightning-Link 流程如圖 1 所示。小瓶內容物的溶解會活化介導抗體標記反應的化學物質。由於沒有純化或分離步驟（反應副產物完全是良性的），抗體回收率接近 100%。此外，使用這種簡單的方法可以在不到三十秒的時間內建立標記反應。

圖 1：Lightning-Link 抗體標記流程

儘管抗體標記程序非常簡單，但化學方法卻很複雜——僅允許在溫和且受控的過程中形成抗體標記綴合物。用 Lightning-Link 標記的抗體表現出的性能特徵與透過費力的多步驟傳統程序製備的抗體相同或更好 – 請參見下圖 2。

圖 2：使用標準方法與 Lightning-Link 製備的綴合物的 ELISA

Lightning-Link 方法的簡單性意味著可以輕鬆放大（或縮小）待標記的抗體量。無論您是標記少量抗體還是大量抗體，操作時間都保持不變 – 只需 30 秒。由於擴大規模不會產生新的技術問題，因此小規模製備的試驗綴合物的性能與大規模製備的試驗綴合物的性能基本相同（參見下圖 3）。對於任何新抗體，或在抗體極其有價值且供應有限的情況下，Lightning-Link 試劑盒允許使用少至 10μg 的抗體進行標記反應。其他常規包裝規格包括 100ug、1mg 和 5mg。

圖 3：使用 Lightning-Link 進行不同尺度標記的抗體的 ELISA

儘管現在進行抗體標記反應的實際操作非常簡單；如上所述，在進行標記反應之前，仍有必要考慮抗體製備中還存在什麼。然而，Lightning-Link 對抗體製劑中的許多添加劑具有顯著的耐受性。

疊氮化鈉廣泛用作市售抗體中的抗菌劑，其含量通常為 0.02% 或 0.1%，會對某些標記方法造成嚴重干擾。幸運的是，Lightning-Link方法受濃度為 0.1% 或更低的疊氮化鈉（圖 4）的影響極小。

圖 4：在有/沒有疊氮化鈉的情況下使用標記的抗體進行 ELISA

市售抗體另一種常見的添加劑是 BSA，用作穩定劑。雖然人們預期 BSA 等分子會對標記反應產生嚴重干擾，但 BSA 對 Lightning-Link 的影響非常有限。事實上，從極少量抗體中去除 BSA 的可能好處可能會被任何嘗試純化過程中抗體的損失所抵消。例如，對於 1% BSA，相當於比 1mg/ml 抗體摩爾過量 20 倍，只需將 BSA 存在下標記的抗體稀釋 1/3000（而不是 1/）即可獲得正常 ELISA 吸光度不含BSA 的反應為10,000（見圖5）。

圖 5：在 BSA 存在下製備的標記抗體的 ELISA