SERVICEBIO系列產品- TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒 (DAB呈色)

DAB（SA-HRP）TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒 SERVICEBIO 貨號G1507-50T

產品介紹:

細胞凋亡(apoptosis)時染色體DNA(chromosomal DNA)的斷裂是一個漸進的過程。染色體DNA( Chromosomal DNA )首先在內源性核酸酶水解酶(endogenous nuclease hydrolase)的作用下降解為50～300 KB的大片段，隨後約30%的染色體DNA在Ca2+和Mg2+依賴性核酸內切酶(ca2+ and mg2+ dependent endonuclease) 的作用下在核小體單元之間隨機切割，形成180～200 BP的核小體DNA聚合物。因此，在細胞凋亡後期，DNA會降解為180～200 BP的片段，斷裂的基因組DNA上會有大量3′-OH末端暴露。末端脫氧核糖核苷酸轉移酶（TDT）是一種不依賴模板的DNA聚合酶( DNA polymerase)，能夠催化脫氧核苷酸(deoxynucleotides )與斷裂的DNA分子的3′-OH末端結合。因此，TUNEL（TDT介導的dUTP缺口末端標記）細胞凋亡檢測試劑盒可用於檢測組織細胞凋亡後期發生的核DNA斷裂。其原理是在TDT酶的作用下，將生物素標記的dUTP（生物素dUTP）添加到基因組DNA斷裂時暴露的3´-OH末端，然後用辣根過氧化物酶（HRP）標記的鏈黴親和素（SA HRP）檢測生物素標記的DNA末端。最後加入HRP的底物混合物（DAB）進行顯色反應，凋亡細胞的細胞核染成棕色，可用一般光學顯微鏡檢測。此試劑盒應用範圍廣泛，適用於石蠟組織切片(paraffin tissue sections)、冰凍組織切片(frozen tissue sections)、細胞爬片(cell climbing slides)、細胞抹片(cell smears)等樣本中的細胞凋亡檢測。

引用文獻: 出自2022 May 12;13(5):451. doi: 10.1038/s41419-022-04914-6

引用文獻: 出自 Int J Mol Med. 2025 Apr;55(4):65. doi: 10.3892/ijmm.2025.5506. Epub 2025 Feb 21.

Preparation

1. PBS磷酸鹽緩衝液（建議G0002）。

2. 固定液：4%多聚甲醛溶於PBS，pH 7.4（建議G1101）。

3. 破膜劑：0.1%-0.5% Triton X-100（建議G1204）。

4. 過氧化氫封孔液：3% H2O2，用PBS配製。

5. 如需染色細胞核，需自行準備蘇木精染液（建議G1004）、蘇木精分化液（建議G0139）以及蘇木精藍化液（建議G1004）。

6. 自行配製DAB顯色劑（建議G1212）、正丁醇、二甲苯、中性樹膠等。

7. 操作時請穿著測試服並戴上一次性手套。

Assay Protocol / Procedures

1. Sample preparation

A. Paraffin embedded tissue section

1) 將石蠟組織切片在室溫下浸泡在二甲苯中5-10分鐘，重複3次；然後浸泡在無水乙醇中5分鐘，重複2次；最後，分別浸泡在梯度乙醇（85%、75%）和雙蒸水中，各5分鐘；

2) 用PBS輕輕潤濕切片，並吸去樣品周圍多餘的液體。用PAP筆沿著組織外周輪廓，在距離組織2-3毫米處畫一個小圓圈，以便後續進行通透性處理和平衡標記。實驗過程中，不要讓樣品乾燥，將處理後的樣品放入濕盒中保持樣品濕潤；

3) 配製蛋白酶K工作液：將蛋白酶K（200 µg/ml）原液以PBS作為稀釋劑，以1:9的體積比稀釋，使終濃度為20 μg/mL；

4) 每份樣本加入100 μL蛋白酶K工作液，完全覆蓋組織，37℃孵育20分鐘；
注意：蛋白酶K處理主要有助於後續步驟中染色試劑在組織和細胞中的滲透性。孵育時間過長或過短都會影響後續標記效率。為了獲得更佳結果，可以優化蛋白酶K的孵育時間。

5) 用PBS溶液浸泡清洗樣品3次，每次5分鐘（蛋白酶K需清洗，否則會幹擾後續標記反應）。處理後的樣品置於濕盒中保持樣品濕潤；

6) （選用步驟） 吸去樣本中多餘的液體，將適量破膜液加入組織中，使其充分浸潤，室溫處理20分鐘；破膜處理完成後，用PBS溶液潤濕樣品3次，每次5分鐘；處理後的樣品置於濕盒中保持樣品濕潤；

7) 吸去樣本中多餘的液體，將適量的3%H2O2（用PBS配製）滴加到組織上，使組織充分浸潤，室溫處理20min（滅活組織中內源性過氧化物酶，且孵育時間不宜過長，否則會發生過氧化氫樣本引起的DNA斷裂，產生假陽性溶液

B. Tissue frozen section

1) 將玻片浸入4%多聚甲醛溶液（溶於PBS）中固定，室溫孵育10-15分鐘；

2) 從固定液中取出薄膜後，在通風櫃中自然乾燥；

3) 將玻片放入純水或PBS中潤濕洗滌，去除玻片上殘留的固定液；

4) 用PAP筆沿著組織外周輪廓，在距離組織2-3 mm處畫一個小圓圈，以便後續進行通透性處理和平衡標記；實驗過程中，不要讓樣品乾燥，將處理後的樣品放入濕盒中，保持樣品濕潤；

5) 配製蛋白酶K工作液：將蛋白酶K（200 µg/ml）原液以PBS為稀釋劑，以1:9的體積比稀釋至終濃度為20 μg/mL；

6) 每份樣本加入100 μL蛋白酶K工作液滴，完全覆蓋組織，37 ℃孵育20分鐘；
注意：蛋白酶K處理主要有助於組織和細胞後續步驟中染色試劑的滲透性。孵育時間過長或過短都會影響後續標記效率。為了獲得更佳效果，可以優化蛋白酶K的孵育時間。

7) 用PBS溶液潤濕樣本2-3次，去除多餘的液體（蛋白酶K需要清洗乾淨，否則會幹擾後續的標記反應）。處理後的樣本置於濕盒中，保持樣本濕潤；

8) （選用步驟） 在組織中加入適量破膜液，使其充分浸潤，室溫處理20分鐘。破膜處理結束後，同樣用PBS溶液沖洗樣本，去除多餘液體。處理後的樣本置於濕盒中保持濕潤；

9) 去除樣本中多餘液體，滴加適量3% H2O2（用PBS配製）於組織上，使其充分浸潤，室溫處理20分鐘（可滅活組織中內源性過氧化物酶，孵育時間不易過長，否則會發生過氧化氫引起的DNA斷裂，導致假陽性盒）；然後用PBS溶液潤濕3次處理後放置濕潤樣本，每次樣本中保持濕潤）。

C. Cell climbing sheet

1) 將貼壁細胞置於Lab Tek培養皿上培養。凋亡誘導處理後，以PBS輕輕沖洗玻片兩次；

2) 在每個玻片室中加入適量4%多聚甲醛溶液（溶於PBS）進行固定，室溫孵育20分鐘；

3) 吸去固定液，加入PBS清洗3次，每次5分鐘；

4) 將每個樣品浸入破膜液中，室溫孵育5分鐘進行通透性處理（註：建議使用2-20 μg/mL蛋白酶K工作液進行消化，37℃處理約10分鐘，具體時間取決於細胞狀態。如果細胞容易脫落，建議使用破膜液處理）；

5) 將清洗後的樣品浸入盛有PBS溶液的開口燒杯中2-3次；在每個玻片槽中加入適量的3% H2O2（用PBS配製），室溫處理20分鐘；

6) 輕輕吸去多餘的液體，加入PBS清洗3次，每次5分鐘；用濾紙小心吸乾玻片上樣品周圍的液體。將處理後的樣品置於濕盒中，保持樣品濕潤。

D. Cell smear

1） 將細胞懸浮於PBS中，濃度約為2×107 細胞/mL，吸取50-100 μL細胞懸浮液於防脫黏玻片上，用乾淨的玻片輕輕鋪展細胞懸浮液；

2） 將玻片浸入裝有4%新鮮多聚甲醛（PBS配製）的染色槽中，固定細胞，4 ℃ 染色25分鐘；

3） 將載玻片浸入PBS中，室溫放置5分鐘，再次清洗；

4） 將每個樣品浸入破膜液中，室溫孵育5分鐘進行通透性處理（註：建議使用2-20 μg/mL蛋白酶K工作液進行消化，37℃處理10分鐘左右，具體時間視細胞狀態而定，若細胞易脫落，建議使用破膜液處理）；

5） 將清洗後的樣品浸入裝有PBS溶液的開口燒杯中，浸泡2-3次；每份樣品加入適量3% H2O2（用PBS配製），室溫處理20分鐘；

6） 輕輕吸去多餘的液體，加入PBS清洗3次，每次5分鐘；最後，用濾紙小心吸乾載玻片上樣品周圍的液體。將處理後的樣品置於濕盒中，保持樣品濕潤。

2. DNase I treatment positive control experiment (optional steps)

樣品通透性處理後，以 DNase I（建議 G3342）處理樣品，製備陽性對照。

1） 將 100 μL 1 × DNase I 緩衝液（配製方法：取 10 μL 10 × DNase I 緩衝液，再加入 90 μL 去離子水混勻）加入通透性樣本中，室溫孵育 5 分鐘；

2） 輕輕吸去多餘液體，加入 100 μL 含 DNase I（20 U/ml）的工作液，室溫孵育 10 分鐘；

3） 輕輕吸去多餘液體，用 PBS 將玻片在染色槽中徹底清洗 3-4 次；

（注意：陽性對照玻片必須使用單獨的染色筒，否則陽性對照玻片上殘留的 DNase I 可能會在實驗玻片上引入高背景）。

3. Marking and testing

1） 平衡：每個樣本加入50 μL等效緩衝液，涵蓋所有待測樣本區域，室溫孵育10分鐘；

2） 標記液配製：冰上解凍生物素dUTP標記液和等效緩衝液，並依照重組TDT酶：生物素dUTP標記液：等效緩衝液=1 μL：5 μL：50 μL（1:5:50）的比例配製足夠所有實驗使用的TDT孵育緩衝液。具體實驗所用試劑體積可依載玻片大小調整；

3） 陰性對照體系：配製不含重組TDT酶的TDT孵育緩衝液，並以ddH2O取代；

4） 標記：盡量去除平衡緩衝液，然後在每個組織樣本中加入56 μL TDT孵育緩衝液，37 ℃孵育1小時；注意不要使玻片乾燥，並將玻片避光保存；

5） 立即以PBS潤濕並清洗組織樣本4次，每次5分鐘；

6） 用濾紙輕輕擦拭樣本周圍的PBS溶液；

7） 鏈黴親和素HRP反應：玻片乾燥後，每個樣本組織加入100 µL（浸潤組織）鏈黴親和素HRP反應液（預先將鏈黴親和素-HRP:TBST=1:200-500稀釋），37 ℃孵育30分鐘；

8） 用PBS清洗樣本3次，每次5分鐘；

9） DAB顯色：配製DAB顯色工作液（現配現用），建議使用G1212。每個樣本加入50-100 µL DAB顯色工作液，將切片置於顯微鏡下即時觀察顯色情況，陽性顯示後立即放入濕盒中，用純水沖洗以終止反應；

10） 蘇木精染核：切片用蘇木精染液染色3-5分鐘後，立即以純水沖洗。用蘇木精分化液分化約2秒後，立即用純水沖洗，再用蘇木精返藍液返藍數秒。染核完成後需在顯微鏡下觀察，若染色過深，可放回分化液中重新分化；若染色過淺，可從蘇木精染核中取出重新染色；

11） 透明：將樣本以新鮮無水乙醇脫水4次，每次5分鐘；用正丁醇浸泡5分鐘，再放入二甲苯中浸泡5分鐘至透明，換回新鮮二甲苯浸泡5分鐘至再次透明；

12） 封片：以中性樹膠封片，自然乾燥或60℃烘乾；

13） 鏡檢：將樣本在白光顯微鏡下觀察（凋亡陽性細胞核染成棕色，正常陰性細胞核染成藍色）。

4. Experiment flow diagram

Component

Component Number	Component	G1507-50T	G1507-100T
1507-1	Recombinant TdT Enzyme	50 μL	2×50 μL
1507-2	Biotin-dUTP Labeling Mix	250 μL	2×250 μL
1507-3	Equilibration Buffer	5×1 mL	10×1 μL
1507-4	Streptavidin-HRP	25 μL	2×25 μL
1507-5	Proteinase K（200 µg/mL）	1 mL	2×1 mL
Manual		1 pc