【液體活組織檢查】cell free Liquid biopsy kits

液體活組織檢查 (liquid biopsy) 是用於描述對患者的血液或其他體液（例如尿液或腦脊髓液（CSF））中的核酸進行的診斷程序的術語。垂死細胞將DNA從其片段化的基因組釋放到血液中。這種“無細胞”DNA可大致分為兩組：較小尺寸的片段（140-160和2-3x倍數）源自細胞內基因組DNA的凋亡分解。較大尺寸的片段主要來源於壞死細胞死亡（壞死），但也有外泌體脫落，以及其他不太了解的過程。可以在健康人中檢測到凋亡來源的DNA片段，而較大尺寸的片段通常不在健康人中發生，因此似乎是更具診斷相關性的物種，特別是在腫瘤學領域。在各種疾病（癌症，心肌梗塞，移植排斥）中通過細胞凋亡或壞死死亡的細胞將DNA從其片段化的基因組釋放到血流中。此外，可以在母親的血液中檢測來自胎兒的DNA。具體的病例是外泌體，30-100nm微泡，它們不是“裸”DNA或RNA，但也含有與起源細胞相同的蛋白質和脂質。實際上，較大DNA片段的比例隨著腫瘤階段的進展而增加。最近的數據表明，在大多數情況下，循環腫瘤DNA（ctDNA）的分析正在忠實地反映在所有已知的癌症轉移中發現的突變，或者甚至優於這種方法（例如，如果標準活組織檢查失敗，或顯示比標準組織活組織檢查），表明對循環腫瘤DNA進行測序可以提供比標準活組織檢查更完整的全身性癌症分子圖片。因此，對來自ctDNA部分的長DNA片段的分析為腫瘤學提供了巨大的機會，以改善癌症患者的診斷和治療。

【液體活組織檢查應該克服兩個主要障礙】

ctDNA含量低: 幾項關於癌症患者液體活檢方法的研究表明，這種方法的成功率與液體活檢時患者的腫瘤質量負荷和腫瘤分期有關，並且在腫瘤腫塊的情況下該方法並不十分成功。因為沒有那麼多腫瘤細胞死亡並將DNA釋放到血液中，所以它很少。因此，關鍵問題是難以從具有非常低的ctDNA含量的血漿樣品獲得結果。此外，該方法在一些腫瘤類型（例如結腸癌）中效果良好，但在其他腫瘤類型（例如膠質母細胞瘤）中則不然，這可能也是由於敏感性問題。

ctDNA“污染”: 目前用於無細胞DNA分析的技術由兩種主要類型的方法組成：A）新一代測序（NGS）：靶向測序，外顯子組測序或全基因組測序。B）Digital PCR：使用來自RainDance或Bio-Rad的技術的BEAMing（珠子，乳劑，擴增和磁性），數字PCR連接測定和基於乳液的ddPCR。下一代測序（NGS）或陣列技術檢測和分析血液中的這些核酸。分析液體活組織檢查（也稱為無細胞DNA或cfDNA）產生的數據顯示，這種方法的巨大潛力可能對醫學診斷產生革命性影響，可能僅與引入磁共振成像的影響類似（MRI）。然而，這些技術不能提供區分這兩個片段群的可能性，或甚至可能有利於較小的片段大小群（例如，不通過大小分級無細胞DNA並直接添加文庫銜接子用於測序）。因此，在健康DNA的背景中稀釋更多的ctDNA。

在當前液體活檢方法的靈敏度和特異性限制是需要技術改進的領域。 TruePrime™液體活組織檢查試劑盒基於TruePrime™技術以及TthPrimPol和Phi29 DNA聚合酶的組合，通過適應性擴增癌症特異性大片段無細胞DNA來解決這一液體活檢敏感性和特異性問題。 TruePrime™介導的ctDNA擴增將特異性擴增，從而從人血漿中選擇更大，更具癌症特異性的DNA片段大小，為評估所有患者的癌症基因組信息提供了極其有用的工具，無論腫瘤負擔如何，具有卓越的靈敏度和特異性。

【液體活檢方法潛在臨床應用】

通過分析來自母親的血液（也稱為基於cfDNA的非侵入性產前篩查（NIPT））診斷胎兒染色體異常（特別是三體性）。移植患者的移植物排斥的診斷和監測（可以在患者的血液中檢測來自宿主免疫細胞攻擊的供體組織的DNA）。診斷和監測癌症疾病。迄今為止數據有限的領域是具有組織壞死或細胞凋亡的其他疾病，例如心肌梗塞。

【為何進行液體活檢】

“液體活組織檢查”的使用在檢測胎兒染色體異常（特別是三體性）方面是最先進的，其中基因組診斷正在挑戰通過超聲和三重測試（AFP，hCG和Estriol）測量頸部厚度的傳統組合（Bianchi）等人，2014）。然而，具有最高醫療影響的領域顯然是腫瘤學，在過去幾年中產生的數據顯示，關鍵的癌症突變主要可以通過液體活檢來檢測，這反映了傳統腫瘤活檢中存在的那些。傳統的癌症診斷方法遠遠不能令人滿意地滿足臨床需求。對於許多癌症類型（例如結腸癌，前列腺癌，乳腺癌），早期診斷癌症篩查方法不夠準確或不夠靈敏，或者對於大多數腫瘤類型（例如膠質母細胞瘤，肉瘤等）根本不存在。在許多情況下，血液標記物，成像和其他程序僅在腫瘤組織顯著生長後檢測癌症。活組織檢查可能是非常侵入性的，大約20％-50％的情況下材料不足以進行結論性分析（Anderson，C。2015），並且一些腫瘤無法進行活組織檢查。這使得傳統技術不適合進行適當的治療監測。液體活檢可能甚至優於標準活組織檢查，例如：可能對腫瘤的所有部分和所有轉移瘤進行取樣。最近的數據表明，在大多數情況下，循環腫瘤DNA的分析忠實地反映了在所有已知的癌症轉移中發現的突變，或甚至優於這種方法（例如，如果標準活組織檢查失敗，或顯示比標準組織更多的突變，則檢測突變活檢）（Lebofsky等，2015），提示對循環腫瘤DNA進行測序可以提供比標準活組織檢查更完整的全身性癌症分子圖片。

獲得患者的血液是沒有問題的。只要相應分析所需的血液量很小（例如幾毫升），就可以容易地採取連續液體活組織檢查來監測癌症治療效果或篩查癌症的複發。該方法的靈敏度對於在非常早期階段檢測癌症是優越的，例如，在治愈性手術後或在基於人群的篩查計劃中再次發生癌症的情況下。如果液體活檢可以改善預防性篩查方案中腫瘤的早期檢測，將導致更高的治愈癌症疾病率，特別是對於早期檢測和預防性檢查手段有限或不存在的腫瘤類型。

幾項關於癌症患者液體活檢方法的研究表明，這種方法的成功率與液體活檢時患者的腫瘤質量負荷和腫瘤分期有關，並且在腫瘤腫塊的情況下該方法並不十分成功。因為沒有那麼多的腫瘤細胞死亡並將DNA釋放到血液中（Bettegowda等，2014; Breitbach等，2014）。此外，該方法在一些腫瘤類型（例如結腸癌）中效果良好，但在其他腫瘤類型（例如膠質母細胞瘤）中不適用，可能也是由於敏感性問題（Bettegowda等，2014）。因此，當前液體活檢方法的靈敏度限制是需要技術改進的領域。 SYGNIS實際上正在運行一項開發計劃，通過其核心技術TruePrime™擴增無細胞DNA來解決這一液體活檢敏感性問題，並希望有助於實現液體活檢的巨大希望。

【什麼是TruePrime™？】

TruePrime™是一種致力於擴增基因組DNA的新技術。雖然目前的MDA依賴於短寡核苷酸來開始擴增，但TruePrime™基於高度加工的Phi29 DNA聚合酶與最近發現的靈長類/聚合酶TthPrimPol的組合。在該設置中，TthPrimPol合成Phi29 DNA聚合酶所需的DNA引物，其允許基因組DNA的指數擴增。 TthPrimPol顯示出有效的靈長類活動，優於dNTP作為底物，與傳統的靈長類動物不同。

TruePrimeTM Necrotic無細胞/外泌體DNA擴增試劑盒: 用於從血漿，血清，尿液或任何其他體液獲得的無細胞DNA開始擴增基因組DNA。TruePrime™Necrotic無細胞/外來體DNA擴增試劑盒採用新型多重置換擴增方法，基於最近發現的DNA引物TthPrimPol與高度保真和高保真Phi29 DNA聚合酶的組合，從細胞開始擴增基因組DNA – 從血漿，血清，尿液或任何其他體液中獲得的DNA *。 Phi29 DNA聚合酶的強鏈置換能力允許TthPrimPol在被Phi29 DNA pol延伸的置換鏈上產生新的引物，導致指數等溫DNA擴增。TruePrime™介導的擴增將優先擴增，因此從無細胞DNA製備物中選擇更大，更具癌症特異性的DNA片段大小群。大於1kb的無細胞DNA分子可以來自壞死細胞死亡或外來體如細胞外囊泡。該試劑盒提供了一種評估所有樣本的癌症基因組信息的方法，無論腫瘤如何，都具有卓越的靈敏度和特異性。 TruePrime Necrotic無細胞/外來體DNA擴增試劑盒在100 pg cfDNA輸入水平上可靠，在不同測序技術中保留SNV和SNV頻率，並允許將cfDNA擴增至允許可靠，高深度測序的水平。

TruePrime Necrotic無細胞/外來體DNA擴增試劑盒通過適應性擴增癌症特異性大片段無細胞DNA來解決液體活檢靈敏度和特異性的問題。
*請注意此試劑盒不能用於擴增凋亡DNA（160-170 bp），請參閱我們的TruePrime™凋亡無細胞DNA擴增試劑盒。TruePrime™凋亡無細胞DNA擴增試劑盒通過指數擴增來自凋亡細胞死亡機制（160-170 bp）的無細胞DNA。靈敏度低至picograms、High amplification yields高擴增產率、靈活性150 ng or 50 µl of cfDNA、採用高保真Phi29 DNA pol具無誤差擴增、沒有來自隨機合成引物的人工製品、簡化的工作流程，減少了實際操作時間TruePrime™凋亡無細胞DNA擴增試劑盒採用新型多重置換擴增方法，從血漿，血清，尿液，腦脊液或任何其他體液中獲得的無細胞DNA中實現精確的DNA擴增。 TthPrimPol在髮夾銜接子上產生引物，其由Phi29 DNA聚合酶延伸。 Phi29 DNA聚合酶的強鏈置換能力使TthPrimPol能夠在新髮夾上合成新的引物，從而產生指數等溫DNA擴增。該試劑盒結合了新型TruePrimeTM DNA擴增技術，以及無細胞DNA預處理的關鍵新步驟，包括末端修復+ dA拖尾反應和髮夾適配器的連接（圖1）（圖2），可實現高效通過滾環DNA擴增方法，通過TruePrimeTM擴增無凋亡細胞DNA。

TthPrimPol在髮夾銜接子上產生引物，其由Phi29 DNA pol延伸。 Phi29 DNA聚合酶的強鏈置換能力使TthPrimPol能夠在新髮夾上合成新的引物，從而產生指數等溫DNA擴增。