環氧合酶（COX）活性測定試劑盒（螢光） | 貨號K549-100

Cyclooxygenase (COX) Activity Assay Kit (Fluorometric)

產品描述：Cyclooxygenase (COX)環氧合酶（COX），也稱為前列腺素 – 內過氧化物合酶（prostaglandin-endoperoxide synthase, PTGS，EC 1.14.99.1），是一種負責形成稱為prostanoids前列腺素的重要生物介質的酶，包括前列腺素prostaglandins，prostaglandins前列環素和thromboxane血栓素。 COX是從arachidonic acid花生四烯酸到前列腺素的生物合成途徑中的中心酶。有兩種已知的同工酶：COX-1和COX-2。 COX-1在許多組織中組成型表達，並且是gastric mucosa胃粘膜和kidney腎臟中的主要形式。在大多數細胞中，COX-2在正常條件下不表達，但在inflammation炎症期間觀察到升高的水平。非甾體抗炎藥（NSAID）對COX的藥理學抑制可以緩解炎症和疼痛的症狀。 BioVision的COX活性測定試劑盒提供了一種簡單，靈敏，高通量的適應性方法，用於檢測生物樣品或純化/粗酶製劑中COX的過氧化物酶活性。該試劑盒包括COX-1和COX-2特異性抑制劑，以區分COX-1和COX-2以及可能存在於樣品中的其他過氧化物酶的活性。檢出限：6μU/ mg。此產品可測量各種生物樣品，或是經由和純化/粗酶製劑中之COX活性。

樣品類型：
粘附和懸浮細胞 (Adherent and suspension cells) 、動物組織 (Animal tissues )，如大鼠肝臟 (rat liver)、純化酶 (Purified enzyme)

用戶自行需提供的試劑和設備
—96孔白色不透明板，平底
—盤式分光光度計（或螢光板讀數器）
—Multi-channel pipette（可調至10μl）
—DMSO，1X PBS，Lysis Buffer 裂解緩衝液（例如1×含1％NP40的PBS），Protease inhibitor Cocktail（Cat＃K272或同等產品）

儲存條件 (Storage Conditions ) 和試劑準備 (Reagent Preparation)
產品儲存在-20°C，避光。 COX-1 Positive Control (K549-100-6) ：用20μl無菌ddH2O (sterile ddH2O)重構。 分裝並儲存在-80°C。 避免反覆凍融。 在兩個月內使用完。 對於短期儲存（約2週）陽性對照可以儲存在-20°C (短期儲存) 。 Positive Control在使用時保持在冰上使用， 穩定性至少~30分鐘。 注意：不要將酶長時間保存在冰上。

Cat # +Size	K549-100
Size	100 assays
Detection Method	Fluorescence (Ex/Em 535/587 nm)
Applications	Measurement of COX activity in various biological samples and purified/crude enzyme preparations
Features & Benefits	• Simple, rapid & convenient assay to measure both COX-1 and COX-2 activity • High-throughput adaptable • Includes COX-1 inhibitor, SC560 & COX-2 Inhibitor, Celecoxib
Kit Components	• COX Assay Buffer • COX Probe (in DMSO) • COX Cofactor (in DMSO) • Arachidonic Acid • NaOH • COX-1, Ovine • SC560, COX-1 inhibitor (in DMSO)
Storage Conditions	-20°C
Shipping Conditions	Gel Pack
USAGE	For Research Use Only! Not For Use in Humans.

樣品製備注意事項

新鮮樣品總是優於冷凍樣品。 若使用冷凍樣品，建議分離後立即冷凍，不要多次凍融（建議在冷凍前將樣品等分）, 冷凍時間不宜過長。建議使用灌注組織樣本來製備組織勻漿。對於未知樣品，我們建議進行試驗性實驗並測試幾個劑量以確保讀數在標準曲線範圍。

操作方法-正確版本請依照原廠操作指示, 以下方法僅提供參考。

一、樣品製備

1. (A) 細胞裂解液 (cell lysate) 製備: 用1倍之10ml PBS洗滌細胞（~2-6 X 10⁶）一次。將細胞重新懸浮於1 ml PBS（1X）中，並將細胞轉移到1.5ml微量離心管。 以500×g離心3分鐘後。 棄去上清液 (supernatant) 後，將細胞沉澱物部分 (cell pellet) 重懸於0.2-0.5ml之裂解液緩衝液 (Lysis buffer)中含有蛋白酶抑制劑混合物緩衝液 ( protease inhibitor cocktail )。 Vortex並冰上反應5分鐘。
2. (B) 組織勻漿製備 ( tissue homogenate): 用1倍PBS（1X）清洗組織（~50-100mg wet）三次。 加入0.2-0.5ml含蛋白酶抑制劑混合物的裂解緩衝液（未提供）並於冰上快速均質化組織。 將細胞裂解物 (A) 或組織勻漿(A) 在12,000×g，4℃下離心3分鐘。 收集上清液並保持在冰上。新鮮樣品總是優於冷凍樣品。 若使用冷凍樣品，建議分離後立即分裝冷凍，不要多次凍融（建議在冷凍前將樣品等分）冷凍時間不宜過長。建議使用灌注組織樣本來製備組織勻漿 (最佳化)。對於未知樣品，我們建議進行試驗性實驗並測試幾個劑量以確保讀數在標準曲線範圍。

注意事項: 套組未提供Lysis buffer (例如1×含1％NP40的PBS) 及protease inhibitor cocktail。

二、標準曲線 (Resorufin Standard, K549-100-7) 製備

1. 將Resorufin 標準品 稀釋至10μM（10 pmol /μl）: 取2μl Resorufin 標準品 (5 mM, in DMSO)至 998μl COX分析緩衝液中，將Resorufin 標準品稀釋至10μM（10 pmol /μl)，取上面配製好之 10μM Resorufin 標準品 (10uM) 50μl 於450μlCOX分析緩衝液中，進一步稀釋至1μM（1 pmol /μl）之Resorufin 標準品。將0,4,8,12,16和20μl的1 pmol /μlSororufin標準品加入到96孔板中的一系列孔中，以產生0,4,8,12,16和20
   pmol / well之Resorufin 標準品。 使用COX Assay Buffer將體積調節至100μl/孔 (100ul, 96ul, 92ul, 88ul, 84ul, 80ul)。稀釋後之標準品不建議再次下個實驗使用。

三、 COX Activity反應液製備 

1. COX Cofactor  200倍稀釋使用：在使用產品之前，將COX Cofactor ( 200倍稀釋使用)。加2μlCOX輔因子 (K549-100-3) 於398μlCOX分析緩衝液中 (K549-100-1 ) (COX Cofactor 200倍稀釋)混合均勻。
2. 花生四烯酸溶液 (Arachidonic Acid solution)製備: 在使用前，取5μlNaOH (K549-100-5 ) 與5μl 花生四烯酸 (Arachidonic Acid, K549-100-4 ) 製備成花生四烯酸溶液 (Arachidonic Acid solution)。 短暫Vortex混合。取上面配製好之稀釋花生四烯酸/ NaOH溶液，加入90μlddH2O，以10倍稀釋使用，短暫Vortex混合。 (根據使用量需增加配製量) 。
3. 對於Positive Control陽性對照和每個樣品，準備2個平行孔。 向其中一個孔中加入2μl DMSO（用於總活性）和其他孔加入2μl COX-1或COX-2抑制劑。 要測量COX-1活性，添加COX-1抑制劑（SC560）並測量COX-2活性，加入COX-2抑制劑（Celecoxib）。 以下為2個反應混合物之量：

在96孔板的每個平行孔中加入88μl反應混合物 (Reaction Mix ) 。 對於陽性對照，用2μl Positive Control 替換樣品反應混合物。 使用pipette 在每個孔中加入10μl稀釋的花生四烯酸/ NaOH溶液同時引發反應。

注意事項:  稀釋後的COX輔因子 ( Diluted COX Cofactor) 在室溫下穩定1小時。 不建議儲存稀釋的COX輔助因子後再使用。稀釋的花生四烯酸/ NaOH溶液在冰上穩定至少1小時。 不建議儲存稀釋的花生四烯酸
酸/ NaOH溶液後再使用。

四、 測量

加入花生四烯酸 (Arachidonic Acid) 後，立即以動力學模式測量螢光（Ex / Em = 535/587 nm）每15秒。 持續30分鐘
注意：反應時間取決於樣品的COX活性。 建議在動力學模式下測量螢光並在線性範圍內選擇兩種時間點（T1和T2），以計算樣品（RFUS）和含抑制劑樣品（RFUI）的COX活性。該標準曲線可以在終點模式下讀取（即在反應時間結束時）。

五、計算：從所有標準讀數中減去0標準讀數。 繪製Resorufin標準曲線。 計算樣本的COX活性
ΔRFU=（RFUS2-RFUS1） – （RFUI2-RFUI1）。 將ΔRFU應用於Resorufin標準曲線，得到B pmol的Resorufin在反應時間內由各自的COX同工酶產生（ΔT= T2-T1）。