粒線體滲透性Transition Pore測定試劑盒 | 貨號KTA4002 (Ex/Em=494/517 nm)

This kit(100T) can detect 1,000T with 100μL of detection system per wel lin 96-well plate.

Mitochondrial Permeability Transition Pore Assay Kit

粒線體(Mitochondria)是細胞的功率中心(power centrals)，在能量生產中起著至關重要的作用。粒線體的損傷( Damage)激活誘導細胞凋亡的信號通路(signaling pathways)。粒線體通透性轉換孔（Mitochondrial permeablity transition pore, MPTP）又稱磁通道(magachannel)，是存在於粒線體(mitochondria)內外膜之間的非選擇性高電導率通道(high conductivity channel)，由多種蛋白質複合物組成(multiple protein complexes)。是由內線粒體膜和外線粒體膜組成的非特異性通道(non-specific channel formed)。

似乎在細胞死亡期間參與粒線體成分的釋放。 在健康細胞中，粒線體通透性轉換孔（mitochondrial permeability transition pore, MPT孔或MPTP）在開放狀態和閉合狀態之間閃爍，但是在細胞死亡過程中，粒線體通透性轉換孔（mitochondrial permeability transition pore, MPT孔或MPTP）顯著改變了粒線體的通透性。 細胞色素C釋放(Cytochrome c release)和粒線體膜電位( mitochondrial membrane potential )的喪失是連續孔活化後的。粒線體通透性轉換孔（ mitochondrial permeability transition pore, mPTP或MPTP；也稱為PTP、mTP或MTP）是在某些病理條件下, 例如創傷性腦損傷( traumatic brain injury)和中風(stroke)在粒線體內膜中形成的蛋白質。開放可以增加粒線體膜對分子量小於 1500 道爾頓的分子的滲透性。根據特定的生物環境，通透性轉變孔、粒線體膜通透性轉變（mPT 或 MPT）的誘導可導致粒線體腫脹( mitochondrial swelling)和細胞透過凋亡或壞死而死亡( cell death)。粒線體通透性轉換孔（Mitochondrial permeablity transition pore, MPTP）可能參與細胞死亡過程中粒線體成分的釋放。細胞正常的粒線體內膜可以維持正常的粒線體電位梯度(mitochondrial potential gradient )，確保細胞的呼吸和能量供應。隨著Ca2+的攝入和釋放，低電導率滲透性過渡孔在打開和關閉之間來回切換。在細胞凋亡(apoptosis )和病理性死亡(pathological death)過程中，粒線體膜電位傳遞孔( mitochondrial membrane potential transfer pore changes)的通透性(permeability)發生變化，Ca2+超載，粒線體穀胱甘肽氧化，活性氧增加，包括隨後細胞色素C的釋放，粒線體膜電位下降等都會導致MPTP的啟動。粒線體通透性轉變孔檢測試劑盒(Mitochondrial Permeability Transition Pore Assay Kit)是一種比僅基於粒線體膜電位分析更直接的檢測 MPTP 開口的檢測方法。

粒線體通透性轉變孔檢測產品介紹:

在粒線體鈣超載的條件下，特別是當伴隨氧化壓力、磷酸鹽濃度升高和腺嘌呤核苷酸消耗時，粒線體內膜上會打開一個非特異性孔，即粒線體通透性轉換孔（ MPTP）。粒線體通透性轉變孔檢測試劑盒(Mitochondrial Permeability Transition Pore Assay Kit) 是比僅基於粒線體膜電位分析更直接的檢測MPTP開放的檢測方法。其原理是：首先透過被動運輸(passive transportation)來加載Calcein AM，Calcein AM是一種用於活細胞螢光標記的細胞染色試劑。它很容易穿透活細胞膜，被細胞內酯酶裂解，形成不透膜的極性分子鈣黃綠素，然後被捕獲在細胞內，使包括粒線體在內的細胞質發出強烈的綠色螢光。添加CoCl2後，細胞質的螢光被CoCl2猝滅，僅在粒線體留下螢光。作為對照，細胞可以負載Calcein AM和CoCl2，並用離子黴素處理，使細胞負載更多的Ca2+，進而引起MPTP的活化和粒線體螢光的猝滅。

Fig. L929 cells was incubated with L929 cells Calcein AM (1X), and the cytoplasm including mitochondria emitted strong green fluorescence (A). After cells were further incubated with CoCl2 (1mM), the green fluorescence of Calcein in the cytoplasm was quenched by CoCl2, leaving only the green fluorescence in mitochondria (B). Cells treated with Ionomycin (0.25μM) induced a large amount of extracellular Ca2+ into the cell, excessive Ca2+ into the mitochondrial matrix, resulting in the opening of MPTP, partial release of Calcein from the mitochondria, and the introduction of cobalt ions into the mitochondria and green fluorescence quenching of Calcein (C).

Product name	Mitochondrial Permeability Transition Pore Assay
Kit components	• Calcein AM (1000×) • CoCl2 (100×) • Ionomycin (200×) • Assay Buffer
Features & Benefits	• High safety: almost no toxicity to cells; • Compatibility with multiple detection methods: can be used in flow cytometry and fluorescence microscopy.
Usage notes	• Do not mix or substitute reagents or materials from other kit lots or vendors.
Storage instructions	Stored at -20℃ for 12 months, protected from light
Shipping	Gel pack with blue ice.
Precautions	The product listed herein is for research use only and is not intended for use in human or clinical diagnosis. Suggested applications of our products are not recommendations to use our products in violation of any patent or as a license. We cannot be responsible for patent infringements or other violations that may occur with the use of this product.
Background	Mitochondrial permeablity transition pore (MPTP), also known as magachannel, is a non selective high conductivity channel that exists between the inner and outer membranes of mitochondria and is composed of multiple protein complexes. MPTP may be involved in the release of mitochondrial components during cell death. The normal mitochondrial inner membrane of a cell can maintain a normal mitochondrial potential gradient to ensure cellular respiration and energy supply. With the intake and release of Ca2+, a low conductivity permeability transition pore switches back and forth between opening and closing. During apoptosis and pathological death of cells, the permeability of mitochondrial membrane potential transfer pore changes, Ca2+ overload, mitochondrial glutathione oxidation, increase of reactive oxygen species, including subsequent release of cytochrome C, and mitochondrial membrane potential decline all lead to the activation of MPTP. Mitochondrial Permeability Transition Pore Assay Kit s a more direct detection method for detecting the opening of MPTP than only based on mitochondrial membrane potential analysis.
Alternative	MPTP

A. 流式細胞儀分析
1. 用所需方法處理細胞。

2. 對於非貼壁細胞，收集1-5×10以離心（300 g，5 分鐘）分離 5 個細胞。用 PBS 清洗兩次並丟棄 PBS。貼壁細胞，先用胰蛋白酶（不含EDTA）消化細胞，然後離心。注意：我們建議將未染色的對照細胞（即未染色）懸浮在經過處理和未經處理的樣本的 1×檢測緩衝液中，以設定流式細胞儀。

3. 分別加入適量的Calcein AM染色液、螢光排隊液、離子黴素對照液，重懸細胞至細胞密度約1×10⁶/毫升。 37℃避光培養30-45分鐘，不同細胞有不同的最佳培養時間。

4. 300 g 離心 5 分鐘收集細胞。加入1mLAssay Buffer，輕輕重懸細胞，300g離心5分鐘收集細胞。

5. 加入400 μL Assay Buffer重懸細胞，再用流式細胞儀分析細胞

B. 螢光顯微鏡分析
1．對於貼壁細胞
(1) 直接在細胞培養板的蓋玻片上培養細胞。處理前在CO2培養箱中37℃孵育至少24小時。

(2)用所需方法處理細胞。透過在沒有誘導劑的情況下孵育細​​胞來製備陰性對照。

(3)用PBS洗滌細胞兩次。

(4)分別在細胞中加入適量的Calcein AM染色液、螢光排隊液、離子黴素對照液。一般情況下，96 孔板每孔加入 100 μL，24 孔板每孔加入 250 μL，12 孔板每孔加入 500 μL，6 孔板每孔加入 1 mL。然後37℃孵育30-45分鐘，避光，不同細胞有不同的最佳培養時間。

(5)孵育結束後，以37℃預熱的新鮮培養基替換染色液，並在37℃避光孵育30min，以確保Calcein AM被乳糖酶充分水解成具有綠色螢光的Calcein。

(6)以PBS洗滌細胞2-3次，加入Assay Buffer覆蓋細胞，然後在螢光顯微鏡下觀察樣本(Calcein AM為綠色螢光，Ex/Em=494/517nm)

2．對於非貼壁細胞
(1) 用所需的方法處理細胞，對細胞進行計數。

(2) 300 g 離心 5 min，收集適當細胞，棄上清，PBS 洗滌細胞 2 次，棄去 PBS。

(3) 分別加入適量的鈣黃綠素AM染色液、螢光排隊液、離子黴素對照液，重懸細胞至細胞密度約1×10⁶/毫升。 37℃避光培養30-45分鐘，不同細胞有不同的最佳培養時間。

(4) 300 g離心5 min，棄上清，緩慢加入1 mL 37℃預熱的培養基重懸細胞，37℃避光孵育30 min，確保Calcein AM被乳糖酶充分水解成Calcein，並發出綠色螢光。

(5) 300 g 離心5 min，棄去大部分培養基，將細胞重懸，滴於玻片上，螢光顯微鏡下觀察樣本。

常見問題解答(Q&A)

Q：該試劑盒目前檢測的樣本類型有哪些？

A：本試劑盒可以對貼壁細胞和懸浮細胞進行檢測，包括：L929 Jurkat等細胞。

Q：組織或粒線體樣品可以檢測嗎？

A：組織的單細胞懸液(Single-cell suspension)可以嘗試。提取出來的粒線體則不適合。

Q：加入氯化鈷(cobalt chloride)後，細胞質內的螢光不淬滅怎麼辦呢

A：可適當減少Calcein-AM的濃度和用量。

Q：最後的結果應該如何分析？不同子群(subgroups)間應該如何比較？

A：據粒線體中Calcein綠色螢光的強弱來判斷粒線體MPTP開放的程度，綠色螢光越強，開放程度越低，綠色螢光越弱開放程度越高。

Q：該試劑盒如何檢測MPTP開放程度？

A：本方法相較基於粒線體膜電位的方法能更直接地檢測到粒線體通透性轉換孔開放程度的變化，根據粒線體中Calcein綠色螢光的強弱來判斷粒線體MPTP開放的程度，綠色螢光越強，開放程度越低，綠色螢光越弱開放程度越高。實驗需要設置陰性對照和陽性對照進行比較，沒有靈敏度和檢測極限數據，螢光顯微鏡、流式均可檢測。

Q：該試劑盒的陰性對照和陽性對照該如何設置？

A：陰性樣本中加入Calcein AM staining solution；陽性樣本中加入Ionomycin control。

Q：該試劑盒染色之後是否可以用DAPI染細胞核呢？

A：如果染核推薦Abbkine的Hoechst 33342活細胞染料(BMD0062)。不可固定。

Q：該試劑盒應該選用哪個通道(channel)進行檢測？

A：選用FITC/488 nm 激發光通道進行檢測。