【基因組工程工具-CRISPR Cas9】提供Knock out/Knock in客製化細胞株
CRISPR Cas9
隨著CRISPR Cas9系統的發現（Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats CRISPR-Associated Proteins 9），科學家現在能夠輕鬆有效地敲除或敲入任何感興趣的基因。 鑑於其易於使用，RNA引導的CRISPR Cas9基因組編輯系統提供了一個非常多功能的平台，並有潛力取代劇烈的鋅指和TALEN方法。
基因組工程工具
在現代系統中，使用CRISPR Cas9技術的靶向基因組編輯有兩個組成部分：1）內切核酸酶;和2）短導向RNA（圖2）。核酸內切酶是來自化膿性鏈球菌的細菌Cas9核酸酶蛋白。 Cas9核酸酶具有切割雙鏈DNA的兩個DNA切割結構域（RuvC1和HNH樣核酸酶結構域），產生雙鏈斷裂（DSB）（4）。 gRNA是工程化的單鏈嵌合RNA，將細菌tracrRNA的支架功能與細菌crRNA的特異性結合（6）。 gRNA的5’末端的最後一個20bp作為歸巢裝置，通過RNA-DNA鹼基配對，將Cas9 / gRNA複合物募集到原始相鄰基序（PAM）上游的特定DNA靶位點。不同菌株和CRISPR Cas蛋白質類型的PAM序列不同，化膿性鏈球菌Cas9的序列是5′-NGG（參見Protospacer Adjacent Motif）。因此，今天可用的適應CRISPR Cas9系統可以針對任何5′-N20-NGG DNA序列並產生精確的雙鏈斷裂（7）。然後通過在幾乎所有細胞類型和生物體中發現的兩種通用修復機制之一來修復DSB：非同源末端連接（NHEJ）或同源性定向修復（HDR）。
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非同源末端連接（NHEJ）修復途徑
在沒有合適的修復模板的情況下，NHEJ修復途徑是用於修復雙鏈斷裂的易錯修復機制。 NHEJ途徑嘗試將DSB的切割末端連接在一起。 然而，該過程通常導致DSB位點的插入或缺失（InDels）突變，導致幀位移或引入永久性破壞靶基因開放閱讀框架的成熟前終止密碼子（圖3）。 雖然NHEJ的InDel結果仍然很大程度上是隨機的，但科學家們可以通過將目標基因的gRNA靶向目標基因的N末端來確保最大的基因破壞。 這將確保幀轉移突變不導致部分功能性基因產物。 設計第一個或第二個外顯子中的gRNA是好的做法，並且在利用NHEJ修復途徑時避免靶向基因的內含子區域（7）。
與Cas9核酸酶的同源性定向修復（HDR）
除了NHEJ，細胞能夠利用被稱為同源性定向修復（HDR）途徑的更精確的修復機制。 這種修復機制可以用於引入對基因組DNA的特異性核苷酸修飾（8）。 在該方法中，與適當的gRNA和Cas9核酸酶一起將與預期編輯部位上游和下游的序列具有高度同源性的DNA修復模板引入細胞。 在這種合適的模板的存在下，較不易出錯的HDR機制可以忠實地通過重組對Cas9誘導的DSB位點進行所需的改變（圖4）。 在設計修復模板時，請確保目標序列不緊隨著PAM序列或PAM序列被排除或突變。 這是為了避免相同的CRISPR Cas9系統修復模板的劣化。
Protospacer相鄰主題
CRISPR Cas9系統可以通過gRNA的設計靶向任何基因組區域，然而，系統的特異性取決於位於靶序列緊鄰下游的啟動子相鄰序列（PAM）（圖5）（3）。 作為細菌和古細菌免疫系統，PAM識別序列激活Cas9的核酸酶結構域，從而作為區分自身與非自身的手段（即防止CRISPR基因座被靶向）（7）。
PAM識別序列取決於衍生Cas9核酸酶的細菌的種類和類型。 最常用的II型CRISPR系統使用來自化膿性鏈球菌的Cas9核酸酶。 這種特異的核酸酶在gRNA序列的3’末端識別5′-NGG。 其他市售的Cas9可以識別其他PAM序列（表1）。
Table 1: PAM Sequences from Different Species and Subtypes of Cas Nucleases
| Species | Subtype | PAM Sequence |
|---|---|---|
| S. pyogenes | II | 5′-NGG |
| S. solfataricus | I-A1 | 5′-CCN |
| S. solfataricus | I-A2 | 5′-TCN |
| H. walsbyi | I-B | 5′-TTC |
| E. coli | I-E | 5′-AWG |
| E. coli | I-F | 5′-CC |
| P. aeruginosa | I-F | 5′-CC |
| S. Thermophilus | II-A | 5′-NNAGAA |
| S. agelactiae | II-A | 5′-NGG |
使用CRISPR Cas9作為基因組編輯工具時的一個重要考慮是脫靶裂解發生的程度。離靶事件可能會導致InDel突變不是最初的意圖，因此會損害所獲得的表型結果。幾項研究已經評估了CRISPR Cas9系統的特異性，並且已經表明通常可以耐受與gRNA的20個鹼基對靶向區的5’末端的錯配。 （6）（9）（10）（11）（12）然而，很難預測這些失配如何影響CRISPR Cas9系統的非目標效應。已經有一些情況報導了在gRNA的靶向區域的5’末端的不匹配不被耐受的情況，以及允許靶向區域3’端的錯配的其他情況（13）。總體來說，CRISPR Cas9系統引入的非目標效應在頻率上是變化的，並且具有挑戰性來預測（7）。
可以使用幾種可用的方法來最小化這些脫靶效應。通過將gRNA序列仔細設計到目標基因，可以最大限度地減少目標效應（參見設計gRNA序列的指導）。通常應用的另一種方法是使用Cas9核酸內切酶的變體形式。該變體具有使得野生型Cas9（Cas9Noase）的切割結構域中的一個失活的突變，並將在稍後詳細討論。最終的方法是減少gRNA的20個鹼基對靶向序列。已經顯示這些截短的gRNA（tru-gRNA）在將Cas9核酸酶引導到預定靶位點時與全長gRNA一樣有效。 Tru-gRNA在脫靶序列上表現出降低的誘變效應，並且對單一或雙重錯配更敏感。 （14）
Cas9雙突變體
Cas9雙突變體或Null突變體是通過突變野生型Cas9的兩個切割結構域而產生的。 這樣的Cas9蛋白保留其通過gRNA與基因組DNA結合的能力：基因組DNA鹼基配對。 與Cas9 Nuclease和Cas9Noase可以實現的永久基因破壞不同，Cas9 Null突變體不引入任何基因組修飾。 通過將Cas9雙突變體與其他效應蛋白融合，CRISPR Cas9系統可以擴展其基因調控，基因組成像，染色質或DNA修飾和染色質免疫沉澱的作用（圖8）（15）（16）（17）（18）（19）。
與蛋白質基因組編輯工具的比較
有兩種常見的基於蛋白質的基因組編輯工具：1）鋅指核酸酶（ZFN）和2）轉錄激活子樣效應核酸酶（TALENs）。 表3比較和對比兩種基於蛋白質的方法與基於RNA的CRISPR Cas9系統（20）。
Table 3: Comparison of current genome editing technologies
| ZFNs | TALENs | CRISPR Cas9 | |
| DNA Binding Domain | Cys2-His2 DNA Binding Protein | Conserved Amino Acid Repeated Motif | Single Stranded gRNA |
| DNA Cleavage Domain | FokI Restriction Endonuclease | FokI Restriction Endonuclease | Cas9 Endonuclease |
| Guiding Mechanism | Protein Guided | Protein Guided | RNA Guided |
| Ease of Design | * | *** | ***** |
| Minimized off-target Effects | ***** | ***** | *** |
| Multiplexibility | ** | ** | ***** |
基因治療
2012年，CRISPR Cas9首次被證明是人類細胞培養基因組編輯工具（21）。 此後，它已被廣泛用於生物體，包括麵包酵母（22），植物（23），斑馬魚（24），果蠅（25），線蟲（26），小鼠（27）和其他幾種生物體。CRISPR Cas9具有成為治療遺傳疾病和病毒感染的治療劑的潛力。 一個研究組使用gRNA靶向HIV-1基因組的長末端重複啟動子，以顯著抑制其在感染的人類細胞中的表達（28）。 隨著研究的快速發展，使用和改進了CRISPR Cas9系統，直到提供可行的基因治療劑才會長久。 事實上，已經建立了諸如Editas Medicine和CRISPR Therapeutics等公司，目的是使用CRISPR Cas9系統開發基因治療。
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